一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112342231 A(43)申请公布日 2021.02.09

(21)申请号 202011191136.7(22)申请日 2020.10.30

(71)申请人 厦门大学

地址 361000 福建省厦门市思明南路422号 申请人 厦门致善生物科技股份有限公司(72)发明人 张永有　　宋娜杰　(74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所

有限公司 35204

代理人 张松亭　游学明(51)Int.Cl.

C12N 15/70(2006.01)C12N 9/24(2006.01)C12N 15/56(2006.01)

权利要求书1页 说明书9页序列表6页 附图4页

(54)发明名称

一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法(57)摘要

本发明公开了一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法。该方法包括将Cod UNG的基因序列克隆到pCold‑sumo质粒构建重组质粒pCold‑sumo‑Cod UNG，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，该感受态同时转化了表达分子伴侣质粒pG‑Tf2，经低温诱导表达得到可溶性的sumo‑Cod UNG融合蛋白。本发明成功克服了Cod UNG表达产物不溶的问题。

CN 112342231 ACN 112342231 A

权　利　要　求　书

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1.含有rCod UNG水解酶的重组载体，其序列见SEQ ID NO:5。2.一种不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)制备含有rCod UNG水解酶的重组载体；该载体带有His tag标签和sumo tag标签；将该重组载体导入含有pG-Tf2分子伴侣质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中；

2)诱导表达；3)纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG酶。3.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述rCod UNG水解酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3；所述重组载体的序列为SEQ ID NO:5。

4.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，步骤2中，诱导表达的培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％胰蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。

5.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导表达条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG,15℃，230rpm，诱导表达16h。

6.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。

7.如权利要求6所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体步骤为将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，超声结束进行第二次离心，离心完取上清进行第三次离心，取上清向其中加入聚乙烯亚胺孵育15-20min后第四次离心；

第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min。8.如权利要求7所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，诱导表达菌液体积：Binding buffer的体积比为20：1；超声破碎的功率为50％，频率为超2s停3s，时间20-25min；所述聚乙烯亚胺:滤液的体积比为1:1000-2000，优选1:1000。9.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的提取步骤为，将上清加入装有Ni-NTA的蛋白提取柱，直至所有上清流过Ni-beeds；再加入与Ni-beeds等体积的Wash buffer洗去杂蛋白，重复1-2次；

再加入Elution buffer洗脱，重复洗脱4-6次，收集所有洗脱液。10.如权利要求2所述不耐热rCod UNG酶的表达纯化方法，其特征在于，所述融合蛋白的纯化为，用rCod UNG蛋白的贮存液透析两次。

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一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法

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技术领域

[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。背景技术

[0002]如今，许多临床和科学研究都依赖于在有限的样本量中对微量分析物的检测和定量，DNA和RNA的分析通常使用实时定量聚合酶链反应，数字聚合酶链反应和第二代测序。分析有限样本量的微量DNA和RNA分子(例如液体活检和单细胞)通常需要进行预扩增，以产生足够量的靶分子，对多个靶标实现可重现、特异性和灵敏的方式进行单重定量。由于这可能需要将目标序列倍增几个数量级，因此后续的样品处理将成为潜在的污染危害，其中高浓度的PCR产物可能会污染下游反应。[0003]在PCR中，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)可以用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)代替。在开始PCR之前，使用尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG)可以降解任何含尿嘧啶的PCR产物，即可消除残留污染物，仅扩增源自原始生物样品的含胸腺嘧啶的靶DNA。[0004]由于传统UNG酶无法完全失活，会造成扩增子的损失因而不利于后续定量。在含有大西洋鳕鱼UNG基因修饰的重组大肠杆菌菌株中产生的Cod UNG，通过适度的热处理可以完全且不可逆地使其失活，则可避免这个问题。[0005]在现有的UNG蛋白表达纯化方法中，常出现表达蛋白构象错误，表达量低，纯化后的UNG酶有降解和杂蛋白，酶活性低等不良结果。使得UNG酶在实际生产和运用上与理想效果存在显著差距。

发明内容

[0006]本发明的主要目的在于提供一种不耐热UNG融合蛋白的表达纯化方法。纯化出的UNG酶纯度高，活性强，无DNase和RNase污染，易失活对PCR无抑制作用。[0007]为实现上述目的，本发明提供一种rCod UNG的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：[0008]制备含有rCod UNG蛋白的重组载体，该重组载体还带有His tag和sumo tag标签；[0009]诱导表达[0010]纯化：利用His tag标签对融合蛋白进行纯化，获得高纯度的rCod UNG蛋白。[0011]进一步，所述rCod UNG蛋白的序列为SEQ ID NO:3；所述pCold-sumo载体的序列为SEQ ID NO:4。[0012]进一步，所诱导表达的诱导培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。[0013]进一步，所述诱导表达的条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG，15℃，230rpm，培养16h诱导蛋白表达。[0014]进一步，所述纯化包括裂解菌体，融合蛋白的提取，融合蛋白的纯化步骤。[0016]进一步，所述裂解菌体步骤为，将诱导表达所得的菌液第一次离心收集菌体，用预

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冷的Binding buffer重悬后，在冰水浴中超声破碎，再第二次离心，取上清第三次离心，再次取上清，向其中加入聚乙烯亚胺(PEI)孵育15-20min后第四次离心；[0017]优选地，第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；[0018]优选地，第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；[0019]优选地，第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；[0020]优选地，第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min；[0021]优选地，诱导表达所得的菌液：Binding buffer的体积比为1:20。[0022]优选地，超声破碎的功率为50％，频率为超2s停3s，时间20-25min。[0023]优选地，所述聚乙烯亚胺(PEI):滤液的体积比为1:1000-2000，优选1:1000。[0024]进一步，所述融合蛋白的提取步骤为，将上清液加入Ni-NTA蛋白提取柱，直至所有上清流过Ni-beeds；再加入与Ni-beeds等体积的Wash buffer洗去杂蛋白，重复1-2次；

再加入Elution buffer洗脱，重复洗脱4-6次，收集所有洗脱液；[0025]进一步，所述融合蛋白的纯化为，用rCod UNG蛋白的贮存液透析即可[0026]本发明通过申请人的设计，制备出含rCod UNG基因的重组载体，转化到含分子伴侣质粒pG-Tf2的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，依靠SUMO tag和分子伴侣的特性，帮助rCod UNG正确折叠组装，在纯化过程中促进蛋白溶解，提高rCod UNG蛋白酶产量。表达出的产物通过His tag标签纯化，获得比天然UNG蛋白酶活性更高的产品。[0027]本发明：[0028]①将rCod UNG表达基因克隆到含6XHis tag和SUMO tag的pCold-SUMO载体上。[0029]②pCold-SUMO载体适合低温诱导表达，有利于诱导表达出的rCod UNG蛋白酶活性的保持。

[0030]③质粒转化的感受态细胞：一般方法直接将表达载体转化到感受态细胞，而本发明的方法，感受态细胞中含分子伴侣质粒，诱导表达时，分子伴侣也会表达，并帮助目的蛋白折叠组装，促进蛋白溶解。[0031]④本发明中，SUMO标签和分子伴侣并不会对酶活性产生影响，反而通过帮助蛋白质正确折叠减少蛋白错误构像，一定程度上使酶活性高于野生型UNG酶。附图说明

[0032]图1是本发明pCold-6XHis-SUMO-rCod UNG表达载体图谱。[0033]图2是一般法诱导rCod UNG小量提取的SDS-PAGE凝胶电泳图。[0034]图3是本发明诱导rCod UNG小量提取的SDS-PAGE凝胶电泳图。[0035]图4是本发明纯化rCod UNG蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。[0036]图5是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行活性检测。[0037]图6是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行DNase污染检测。[0038]图7是对本发明纯化得到的rCod UNG蛋白酶进行RNase污染检测。[0039]图8是对本发明纯化的rCod UNG失活温度检测，并与Thermo公司售卖的UNG作比较。

[0040]图9是本发明纯化所得酶对PCR反应抑制效果的测试结果。[0041]图10是本发明对rCod UNG蛋白酶消化能力测试结果。

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具体实施方式

[0042]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中，其中相同的标号表示相同的元件。参考附图描述的实施例旨在解释本发明，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。[0043]以下实施例的SEQ ID NO:1由上海生工生物工程有限公司合成，SEQ ID NO:2由苏州金唯智生物技术有限公司合成。其中所述rCod UNG对应的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示，pCold-sumo载体序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:1

tagtgagctcggtaccATGttcggagagacttggagSEQ ID NO:2

AcctatctagactgcattagagtgctctccagtttaSEQ ID NO:3

ATGttcggagagacttggagaagagagctggctgcagagtttgaaaagccatacttcaaacaattgatgtcctttgtagctgatgagaggagccgtcacaccgtctacccaccggctgatcaagtgtacagttggacagagatgtgtgacattcaagatgtgaaagtagtgattctaggccaggacccttaccacggtcccaaccaagcacatggactctgtttcagtgtgcaaaagccagttccccctccccccagtctcgtgaacatatacaaagaattgtgtaccgacattgatggcttcaagcatcctggacatggagatctaagcggatgggcaaaacaaggggtgctgctgcttaacgcggtgctgaccgtgcgggcccatcaggccaactcccacaaggacagaggctgggagaccttcaccgacgctgtgatcaagtggctgagcgtcaaccgggaaggagtggttttcctgttgtggggctcatacgcccataagaagggagcgaccatcgacaggaaacgtcaccatgtcttgcaagctgttcatccatctcctttgtctgctcatcgtgggttccttggttgtaagcacttctccaaggctaacgggctgctgaaactatctgggacggagcctataaactggagagcactctaa

SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

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[0044]性内切酶PstI-HF(货号R3140S)和KpnI-HF(货号R3142S)均由NEB公司生产。[0045]PFX DNA聚合酶由厦门大学生命科学学院张永有课题组纯化。[0046]实施例1：pCold-SUMO-rCod UNG载体的构建[0047]PCR扩增rCOD UNG基因序列，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，以SEQ ID NO:3(上海生工生物工程有限公司合成)为模板，以PFX为DNA聚合酶，扩增体系50ul，扩增条件为98℃，2min；98℃，15s；℃，15s；72℃，15s；72℃，2min，共35个循环，得到PCR产物1。[0048]以1.2％(w/v)琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带进行胶回收，得到产物1。[0049]双酶切载体pCold-SUMO(SEQ ID NO:4)，PstI-HF和KpnI-HF各20U消化3ug pCold-SUMO质粒，于37℃水浴反应4hr，1.2％琼脂糖凝胶电泳后切下目的条带进行胶回收，得到产物2，并将酶切产物转化TOP10感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司，货号：DL1010)，涂板后培养过夜，观察酶切是否彻底。

所诱导表达的培养基为重量体积百分比的1％NaCl；重量体积百分比的1％胰蛋白胨；重量体积百分比的0.5％酵母提取物。诱导表达条件为OD600为0.5-0.7，加入0.25mM IPTG，15℃，230rpm，培养16h。

[0050]使用不依赖连接酶的连接反应进行重组质粒克隆，反应体系如下：30ng双酶切pCold-SUMO载体回收产物(产物2)，20ng rCod-UNG PCR回收产物(产物1)，20U EoxIII(购自TAKARA公司)，1ul 10X EoxIII reaction buffer，加水补足至10μL。冰浴反应1h，加1ul 0.5M EDTA(pH 8.0)，65℃反应10min后插回冰上备用。[0051]取100ul TOP10感受态细胞，冰上融化后加入到上述连接产物中，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。[0052]挑取单克隆，用5ml氨苄培养基，37℃，200rpm摇菌12h，取1ul进行菌液PCR，电泳正确的送去测序(厦门铂瑞生物技术有限公司)，测序正确的命名为pCold-6XHis-sumo-rCod-UNG，载体图谱见图1。

[0053]其余菌液利用质粒小提试剂盒(购自天根生化科技有限公司，货号DP103-03)提取pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体。[0054]实施例2：6XHis-SUMO-rCod-UNG的小量表达

[0055]pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体的菌株制备：取实施例1所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体25ng，加入到100μL 5种含不同分子伴侣质粒(见图3)的BL21(DE3)感受态细胞(购自上海近岸科技有限公司)，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。

[0056]对比例：一般法制备pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达菌株[0057]pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体的菌株制备：取实施例1所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达载体25ng，加入到100μL BL21(DE3)感受态(购自Invitrogen)，冰浴30min后42℃热激90s，插回冰上静置2min，涂布于氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养基，37℃恒温培养箱倒置过夜。[0058]挑取单克隆，用5ml氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养液，37℃，200rpm培养12h，转接到5ml氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)双抗性LB培养液，

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培养至OD600在0.5-0.7之间时，取出菌液冰上预冷5min，然后加入工作浓度为0.25mM IPTG，15℃诱导过夜。

[0059]rCod-UNG小量提取：[0060]①裂解菌体：取上述过夜的5mL菌液，配平后于2500g，4℃离心15min收集菌体。放入-80℃冷冻30min，取出冷冻的菌体用预冷的0.5ml His tag Binding buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，5mM咪唑，10％甘油(v/v)，1mM PMSF，0.2mMβ-ME)充分重悬菌体(诱导表达菌液体积：His tag Binding buffer体积＝10：1)，在冰水浴中超声破碎，功率为10％，频率为超2s停3s，时间5min。[0061]11000g，4℃，10min离心，取上清40μl加入10μL 5XSDS-PAGE上样缓冲液(Tris-HCl(pH6.8)(50mM)；SDS(2％)；溴酚兰(0.1％)；甘油(25％)；β-巯基乙醇(14.4mM)，沉淀用1X SDS-PAGE上样缓冲液重悬，95℃，10min使蛋白变性，然后插回冰上备用。[0062]实施例2与对比例小提获得的蛋白上清和沉淀每个样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，上层胶90V，20min；下层胶150V，50min。[0063]考马斯亮蓝染色，电泳结束取下凝胶，加30ml考马斯亮蓝(考马斯亮蓝R 250100mg溶于500ml甲醇中，加100ml冰醋酸，水补足至1L)室温染色1h，然后加入40ml脱色液(甲醇：乙酸：水＝5：1：4)，室温脱色，每隔30min换一次脱色液，脱色3-4次，结果见图3。由图3可以看出：本发明制备的rCod UNG蛋白表达菌经诱导表达后，蛋白溶解度明显提高。[00]实施例3：6XHis-SUMO-rCod-UNG的纯化[0065]①蛋白的大量诱导表达：取实施例2所得pCold-6XHis-SUMO-rCod-UNG表达菌株，过夜培养获得种子液，按1：100的比例转接到1L含氨苄青霉素(30μg/ml)和氯霉素(10μg/ml)的液体LB中，37℃摇床，200rpm培养至OD600到0.5-0.7时取出置于冰上冷却15min，然后加入终浓度为0.25mM的IPTG，置于15℃，200rpm摇床培养16h诱导蛋白表达。[0066]②裂解菌体：第一次离心收集菌体，收集的细胞置于-80℃，冻存30min以上，取出冷冻过的菌体用预冷的50ml His-tag Binding buffer重悬细胞(诱导表达菌液体积：His tag Binding buffer体积＝20：1)。在冰水浴中超声破碎细胞，50％功率，超声2秒，停3秒，共超声20min。超声结束进行第二次离心，离心完取上清进行第三次离心，上清转移到另一干净离心管，一边搅拌一边向其中加入聚乙烯亚胺(PEI)(来源于安耐吉化学，编号：D110141，批号：E8NRD7RK，聚乙烯亚胺：上清液＝1：1000)，混匀后置于冰上15-20min后进行第四次离心；

第一次离心的条件为2500g，4℃离心10min；第二次离心的条件为11000g，4℃离心10min；第三次离心的条件为1100g，4℃离心10min；第四次离心的条件为1100g，4℃离心15min；[0067]③纯化：取1ml Ni-NTA agarose(Lot No.160042951)加入滤柱，分别用Elution buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，250mM咪唑，10％甘油(v/v)，1mM PMSF，0.2mMβ-ME)、Wash buffer(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，25mM咪唑，10％甘油(v/v)和His tag Binding buffer各10ml洗Ni-NTA柱，加入上清使其流过Ni-NTA agarose，然后加2ml Wash buffer洗脱杂蛋白，最后用2ml Elution buffer分四次洗脱目的蛋白。[0068]得到的蛋白经SDS-PAGE检测后，转移到透析袋中4℃透析过夜，更换新的透析液再

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透析4h，从透析袋取出补加甘油使其终浓度为50％。BCA法测定蛋白浓度(BCA蛋白定量试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，货号E713DA0001)后，按需稀释，-80℃长期保存。SDS-PAGE电泳结果见图4，可以看到，本发明纯化出的rCod UNG无明显降解及杂蛋白产生。[0069]对本发明纯化所得rCod UNG进行活性检测，结果见图5。[0070]对本发明纯化所得rCod UNG进行DNase污染检测，结果见图6。[0071]对本发明纯化所得rCod UNG进行RNase污染检测，结果见图7。[0072]对本发明纯化所得rCod UNG进行失活温度检测，将UNG置于50℃放置10min或不处理后进行活性的检测，同时比较市售UNG酶(Thermo)失活温度，结果见图8。[0073]对本发明纯化所得rCod UNG进行PCR抑制能力进行测试，结果见图9。[0074]对本发明纯化所得rCod UNG消化能力进行测试，模板为含U的纯化后的PCR产物，结果见图10。[0075]综上，本发明建立了不耐热UNG蛋白表达方法，解决了不耐热UNG蛋白表达不溶解的问题。并从核酸酶污染、热失火温度、对PCR抑制能力、消化能力几个方面对所纯化的SUMO-UNG进行检测。可以看到，本发明表达纯化得到的rCod UNG酶可溶解、无DNase和RNase污染且具有活性，并且不耐热，易从反应中去除，对PCR反应无抑制作用。

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序列表<110> 厦门大学

厦门致善生物科技股份有限公司<120> 一种不耐热UNG融合蛋白的重组载体及表达纯化方法<160> 5<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 36<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1tagtgagctc ggtaccatgt tcggagagac ttggag 36<210> 2<211> 36<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2acctatctag actgcattag agtgctctcc agttta 36<210> 3<211> 666<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3atgttcggag agacttggag aagagagctg gctgcagagt ttgaaaagcc atacttcaaa 60caattgatgt cctttgtagc tgatgagagg agccgtcaca ccgtctaccc accggctgat 120caagtgtaca gttggacaga gatgtgtgac attcaagatg tgaaagtagt gattctaggc 180caggaccctt accacggtcc caaccaagca catggactct gtttcagtgt gcaaaagcca 240gttccccctc cccccagtct cgtgaacata tacaaagaat tgtgtaccga cattgatggc 300ttcaagcatc ctggacatgg agatctaagc ggatgggcaa aacaaggggt gctgctgctt 360aacgcggtgc tgaccgtgcg ggcccatcag gccaactccc acaaggacag aggctgggag 420accttcaccg acgctgtgat caagtggctg agcgtcaacc gggaaggagt ggttttcctg 480ttgtggggct catacgccca taagaaggga gcgaccatcg acaggaaacg tcaccatgtc 540ttgcaagctg ttcatccatc tcctttgtct gctcatcgtg ggttccttgg ttgtaagcac 600ttctccaagg ctaacgggct gctgaaacta tctgggacgg agcctataaa ctggagagca 660ctctaa 666<210> 4<211> 4740<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcatat cgaaggtagg 300catatgggcg gtggcggtag cggcggtggc ggtagcggta tgtcggactc agaagtcaat 360caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 420gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 480ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 540gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 600attattgagg ctcacagaga acagattggt ggtactagtg agctcggtac cctcgaggga 660tccgaattca agcttgtcga cctgcagtct agataggtaa tctctgctta aaagcacaga 720atctaagatc cctgccattt ggcggggatt tttttatttg ttttcaggaa ataaataatc 780gatcgcgtaa taaaatctat tattattttt gtgaagaata aatttgggtg caatgagaat 840gcgcaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 900gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 960gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 1020gattgtactg agagtgcacc ataaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt 1080aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 1140taaatcaaaa gaatagcccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 1200actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 1260cccactacgt gaaccatcac ccaaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 1320aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 1380ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 1440ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta 1500ctatggttgc tttgacgtat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 1560cgcatcaggc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1620ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1680aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1740tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1800atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1860agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1920tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1980tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 2040atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 2100ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 2160tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 2220

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