液相色谱-串联质谱法以锂加合离子定量分析大鼠血浆中紫杉醇和羟基代谢物

醇和羟基代谢物

范亚新;陈笑艳;马智宇;高志伟;钟大放

【摘 要】为了提高大鼠血浆中紫杉醇和羟基代谢物的检测灵敏度,本工作探索了加入金属离子的液相色谱-串联质谱联用方法.紫杉醇质谱分析时,易产生碱金属(Li+、Na+、K+)加合离子.采用未添加碱金属离子的流动相分析时,[M+H]+质谱响应低,[M+Na]+稳定性差.本实验以碳酸锂作为试剂,同时定量测定大鼠血浆中紫杉醇和羟基代谢物,紫杉醇的线性范围为1.00～8 000 μg/L,3’-p-羟基紫杉醇的线性范围为0.50～50 μg/L.本方法专属性好,准确、快速,适用于注射用紫杉醇(白蛋白结合型)的药代动力学研究.锂加合离子稳定性好、质谱响应高、碰撞能量低,适用于一些中性化合物的定量和结构分析. 【期刊名称】《质谱学报》 【年(卷),期】2013(034)003 【总页数】8页(P137-144)

【关键词】锂加合离子;紫杉醇;羟基代谢物;液相色谱-串联质谱 【作 者】范亚新;陈笑艳;马智宇;高志伟;钟大放

【作者单位】浙江工业大学,浙江杭州310014;中国科学院上海药物研究所,上海201203;中国科学院上海药物研究所,上海201203;中国科学院上海药物研究所,上海201203;中国科学院上海药物研究所,上海201203;浙江工业大学,浙江杭州310014;中国科学院上海药物研究所,上海201203

【正文语种】中 文 【中图分类】O657.73

紫杉醇是从红豆杉的树皮中提取的天然抗癌化合物，临床应用于多种癌症的治疗[1]，其结构示于图1。常用剂型为普通注射液 (Taxol®)，其中含有聚氧乙烯蓖麻油溶媒，容易引起过敏性反应，甚至是过敏性休克[2-3]。注射用紫杉醇 (白蛋白结合型) (商品名Abraxane®) 是把紫杉醇和纳米白蛋白颗粒结合在一起的新型纳米制剂[2]，用于转移性乳腺癌联合化疗失败后或辅助化疗6个月内复发的乳腺癌的治疗。与普通注射液相比，该制剂不含聚氧乙烯蓖麻油溶媒，具有过敏反应少、静注时间短、作用时间长等优点[4]。紫杉醇在体内主要代谢途径是羟基化，人血浆、胆汁、尿和粪中的主要代谢物是3’-p-羟基紫杉醇和6α-羟基紫杉醇，大鼠肝细胞、肝微粒体和胆汁中的主要代谢物为3’-p-羟基紫杉醇和2-羟基紫杉醇[5-7]，在人与大鼠体内都产生3’-p-羟基紫杉醇。3’-p-羟基紫杉醇有一定的抗癌活性和微管稳定作用[8]，并保留了原形的一部分骨髓毒性[9]，因此对血浆中的紫杉醇及其代谢物3’-p-羟基紫杉醇的药代动力学研究很有意义，可为临床试验提供一定的科学依据。

但以紫杉醇为代表的一些中性化合物因其不含酸性或碱性基团，在质谱中较难离子化，给分析带来了困难。对这些化合物的质谱分析需添加一定的试剂形成加合离子，正离子模式下可用碱金属盐或烷基铵盐[10-13]。Casetta等[11]在测定血清中1α,25(OH)2-维生素D3时，以醋酸锂作为试剂，其加合离子稳定，即使在MS/MS中有H2O损失也不受影响。本工作以碳酸锂作为试剂，利用锂加合离子检测，建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定大鼠血浆中紫杉醇和其羟基代谢物，并应用于注射用紫杉醇 (白蛋白结合型)的药代动力学研究。 1.1 主要仪器与装置

Agilent 60型三重四极杆串联质谱仪：美国Agilent公司产品，配有电喷雾电离源及Mass Hunter数据采集软件；Agilent 1200液相色谱系统：美国Agilent公司产品；Turbo Vap蒸发仪：美国Zymark公司产品；Milli-Q Gradient超纯水系统：法国Millipore公司产品。 1.2 主要材料与试剂

紫杉醇：纯度99.2%，批号11203028，齐鲁制药公司产品；3’-p-羟基紫杉醇：纯度95.0%，批号SLBC4473V，美国Sigma公司产品；多西他赛 (选作紫杉醇测试的内标纯度98.0%，批号100666-201002)：中国药品生物制品检定所提供；注射用紫杉醇 (白蛋白结合型)：美国Abraxis BioScience公司产品；碳酸锂、甲基叔丁基醚：国药集团化学试剂有限公司产品。甲醇、乙腈(色谱纯)：德国Merck公司产品；醋酸铵(色谱纯)：德国Fluka公司产品；空白大鼠血浆：上海药物研究所动物实验中心提供。 1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB C8柱 (150×4.6 mm×5 μm)；C18保护柱 (4.0×3.0 mm×5 μm)；流动相：V(乙腈)∶V(10 mmol/L醋酸铵)∶V(100 mmol/L碳酸锂)=60∶40∶ 0.1的混合溶液；流速梯度：0～1.4 min为 1.5 mL/min，1.41～4.2 min为0.65 mL/min，4.21～4.5 min为1.5 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源 (ESI源)，正离子多反应监测 (MRM) 模式，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，雾化气压力138 kPa，鞘气温度380 ℃，鞘气流速12 L/min，毛细管电压4 500 V，喷嘴电压1 000 V。紫杉醇、3’-p-羟基紫杉醇和内标多西他赛的碰撞能量均为20 V，毛细管出口碰撞电压为200 V。用于定量分析的离子反应分别为m/z 860→m/z 292 (紫杉醇)、m/z 876→m/z (308+515+575) (3’-p-羟基紫杉醇) 和m/z 814→m/z 288 (内标多西他赛)。

1.4 血浆样品预处理

取50.0 μL血浆，分别加入25.0 μL 1.00 mg/L内标多西他赛、100 μL乙腈和100 μL去离子水，涡流混匀，加入3.0 mL甲基叔丁醚，涡流5 min，以3 500 r/min离心5 min 。取上层有机相于另一试管中，40 ℃空气流下吹干，残留物加入100 μL流动相溶解，涡流1 min，进样10 μL。 2.1 大鼠血浆中羟基化代谢物的鉴定

采用三重四极杆质谱对大鼠血浆中羟基化代谢物进行定性分析。采用[M+Na]+进行m/z 2→m/z 2质谱扫描并色谱分离，排除空白基质的影响，再进行二级扫描，得到相应的碎片离子，共检测到2个羟基代谢产物，命名为M1和M2，其色谱图示于图2。其中，M1与3’-p-羟基紫杉醇的质谱碎片相吻合，且色谱行为一致，确定M1为3’-p-羟基紫杉醇；M2的碎片离子为m/z 308、547和607，与6α-羟基紫杉醇的质谱碎片相同，但色谱行为不同，因此M2不是6α-羟基紫杉醇。为了排除葡萄糖醛酸结合物源内裂解的干扰，对其进行了质谱监测，结果表明，大鼠血浆中不存在紫杉醇葡萄糖醛酸和硫酸结合物。 2.2 质谱条件优化

将紫杉醇用乙腈稀释至一定浓度，在不同流动相下进行一级全扫描，其质谱图示于图3。在未添加碱金属离子的流动相中，(V(乙腈)∶V(10 mmol/L醋酸铵)=60∶40的混合溶液为原始流动相)基峰离子为[M+Na]+，其余加合离子为[M+H]+和[M+K]+，[M+H]+的质谱响应较小。添加Li2CO3至0.1 mmol/L后，[M+Li]+为主要加合离子，质谱响应显著增加。紫杉醇是一个中性化合物，对比未添加碱金属离子流动相中[M+H]+和[M+Na]+两天的质谱响应，[M+Na]+质谱响应增加1倍，而[M+H]+响应几乎不变。加入不同量的甲酸观察其对[M+Na]+响应的抑制，抑制效果均不佳，其羟基代谢物结果类似。

对紫杉醇不同加合离子进行二级产物离子扫描，其质谱图示于图4。[M+Li]+、

[M+Na]+和[M+K]+主要碎片离子分别比[M+H]+的碎片离子大6、22和38 u，推测断裂方式均为C13位侧链酯键断裂，裂解的碎片离子均加合碱金属离子。不同加合离子的碰撞能量列于表1，由表1可知，[M+Li]+的碰撞能量均低于[M+Na]+和[M+K]+。在低碰撞能量下(5 V)，[M+Li]+产生少量碎片离子，而[M+Na]+几乎不能打碎；在高碰撞能量下(50 V)，[M+Li]+的碎片信息较[M+Na]+丰富，适用于较高分子质量的中性化合物结构分析与测定。3’-p-羟基紫杉醇和内标的二级全扫描质谱图示于图5。 2.3 色谱条件优化

紫杉醇溶液在代谢物通道m/z 876→m/z 308产生与原形保留时间一致的色谱峰，对分析造成一定的干扰。可能的原因为[M+Li]+、[M+Na]+、[M+K]+质荷比相差16 u，而3’-p-羟基紫杉醇与原形质荷比也相差16 u，详细数据列于表2。由于其产物离子分别加合了Li+、Na+、K+，因此质谱无法区分，待测物之间需要进行完全的色谱分离。通过降低有机相比例，延长保留时间，可以将其完全分离，总分析时间为4.5 min。人体中的主要羟基化代谢物为6α-羟基紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇，在该色谱条件下，两者的色谱行为较接近，但其碎片离子不同，所以此色谱方法也适用于人血浆中紫杉醇和羟基代谢物的同时测定。

有文献[14]报道采用0.5 mmol/L碳酸锂作为流动相添加剂测定人血浆中怕伐他汀，考虑到碳酸锂为非挥发性盐类，且在乙腈中的溶解度较低，本实验将碳酸锂的用量降至0.1 mmol/L。 2.4 预处理方法的选择

文献在测定血浆中的紫杉醇及其羟基代谢物时采用液-液萃取或固相萃取进行血浆预处理，在方法建立初期曾采用沉淀蛋白法，但基质效应较强[15-20]。为避免此现象，采用液-液萃取，并对提取试剂进行考察。血浆样品用V(甲基叔丁醚)∶V(乙醚-二氯甲烷)=2∶1 提取后进行LC-MS/MS分析，甲基叔丁醚的提取效率较高且

稳定，选用为提取试剂。 2.5 方法学确证

2.5.1 方法的专属性 分别取6只大鼠的50.0 μL空白血浆，除不加内标溶液外，按1.4项操作，得色谱图6a；将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图6b；取大鼠约药后的50.0 μL血浆样品，按1.4项操作，得色谱图6c。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰待测物及内标的测定。 2.5.2 线性范围和定量下限 取50.0 μL空白血浆，分别加入50.0 μL紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇标准系列溶液(紫杉醇/3’-p-羟基紫杉醇相对于血浆药物浓度为1.00/0.50，3.00/1.00，10.0/2.50，30.0/5.00，100/15.0，300/50.0，1 000，3 000，8 000 μg/L)，按1.4方法处理后进样分析，建立标准曲线。以血浆中待测物浓度x (μg/L)为横坐标，待测物与内标的峰面积y为纵坐标，用加权最小二乘法 (W=1/x2) 进行回归计算，得回归方程，即标准曲线。紫杉醇典型的回归方程为y=6.49×10-3x+7.00×10-3，R2=0.990 5；3’-p-羟基紫杉醇典型的回归方程为y=4.28×10-3x-4.45×10-4，R2=0.994 7。

取50.0 μL定量下限样品，按1.4项操作，连续3天进行6样本分析，紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇的日内、日间精密度 (RSD)均小于11.3%，准确度 (RE) 为-3.8%～0.6%，该方法的紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇的定量下限分别可达1.00和0.50 μg/L。

2.5.3 精密度和准确度 取50.0 μL QC样品(紫杉醇/3’-p-羟基紫杉醇血浆浓度分别为10.0/1.00，100/15.0和6 400/40 μg/L)，按1.4项操作，每一浓度进行6样本分析，连续测定3天。紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇的QC样品的日内、日间精密度均小于14.3%，准确度在-4.5%～2.3%之间。

2.5.4 提取回收率和基质效应考察 待测物及内标的提取回收率均在92.5%～107%之间，RSD均小于13.9%；基质效应均在86.2%～104%，RSD均小于13.5%。

表明本实验的LC-MS/MS条件可有效地避免大鼠血浆基质效应。

2.5.5 稳定性考察 考察低、高浓度QC样品室温放置6 h、血浆样品处理后室温放置24 h及3次冻融稳定性 (-70 ℃至室温)，每一浓度水平进行3样本分析。在上述条件下，紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇的准确度均在-9.2%～8.8%之间，精密度小于11.2%。

2.5.6 稀释试验 取稀释QC样品(紫杉醇血浆浓度为32.0 mg/L)，用大鼠空白血浆稀释5倍，进行6样本分析。紫杉醇的精密度为9.4%，准确度为6.7%。结果表明，血浆样品经空白血浆稀释5倍后，不影响测定结果的准确性。 2.6 方法应用

取3只成年、健康的雄性SD大鼠，体重180～220 g，年龄7～8周，静脉推注给予15 mg/kg注射用紫杉醇 (白蛋白结合型)。采集给药前及给药后2 min、5 min、15 min、0.5 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、10 h、24 h和48 h血样，分离血浆置于-70 ℃保存。原形紫杉醇和3’-p-羟基紫杉醇的平均血浆浓度-时间曲线示于图7。实验数据经WinNonlin5.3软件处理，采用非房室计算主要药动学参数，结果列于表3。

本研究建立了以碳酸锂作为试剂，同时测定大鼠血浆中紫杉醇和羟基代谢物的LC-MS/MS方法。锂加合离子稳定性好、碰撞能量低、灵敏度高，适用于一些中性化合物的定量和结构分析。本方法灵敏度高，血浆用量为50.0 μL，紫杉醇定量下限为1.00 μg/L，3’-p-羟基紫杉醇定量下限为0.50 μg/L，能够满足紫杉醇及其羟基代谢物的药动学研究。

【相关文献】

[1] FERLINI C, OJIMA I, DISTEFANO M, et al. Second generation taxanes: From the natural framework to the challenge of drug resistance[J]. Curr Med Chem Anti-Cancer Agents,

2003, 3: 133-138.

[2] MIELE E, SPPINELLI G P, MIELE E, et al. Albumin-bound formulation of paclitaxel (Abraxane® ABI-007) in the treatment of breast cancer [J]. Int J Nanomedicine, 2009, (4): 99-105.

[3] GARDERN E R, DAHUT W L, SCRIPTURE C D. Randomized crossover pharmacokinetic study of solvent-based paclitaxel and nab-paclitaxel [J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(13): 4 199-4 205.

[4] GRADISHAR W J. Albumin-bound paclitaxel: A next-generation taxane[J]. Expert Opin Pharmacother, 2006, 7(8): 1 041-1 053.

[5] JAMIS-DOW C A, KLECKER R W, KATKI AG,et al. Metabolism of taxol by human and rat liver in vitro: a screen for drug interactions and interspecies differences[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1995, 36: 107-114.

[6] ANDERSON C D, WANG J, KUMAR G N, et al.Dexamethason induction of taxol metabolism in the rat[J]. Drug Metab Dispos, 1995, 23: 1 286-1 290.

[7] MONSARRAT B, MARIEL E, Cros S, et al. T-axol metabolism isolation and identification of three major metabolites of taxol in rat bile[J]. Drug Metab Dispos, 1990, 18(6): 5-901. [8] ARORA V. Antisense strategies for redirection of drug metabolism:Using paclitaxel as a model[J]. Methods Mol Med, 2004, 106: 273-292.

[9] SPRATLIN J, SAWYER M B. Pharmacogenetics of paclitaxel metabolism[J]. Crit Rev Oncol/Hematol, 2007, 61: 222-229.

[10] CECH N B, ENKE C G. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals[J]. Mass Spectrom Rev, 2001, 20： 362-387.

[11] CASETTA B, JANS I, BILLEN J, et al. Development of a method for the quantification of 1α,25(OH)2-vitamin D3 in serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry without derivatization[J]. Eur J Mass Spectrom, 2010, 16(1): 81-.

[12] TARVAINEN M, PHUPHUSIT A, SUOMELA J P, et al. Effects of antioxidants on rapeseed oil oxidation in an artificial digestion model analyzed by UHPLC-ESI-MS[J]. J Agric Food Chem， 2012, 60： 3 5-3 579.

[13] HAMILTON J F, LEWIS A C, CAREY TJ, et al.Characterization of polar compounds and oligomers in secondary organic aerosol using liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Anal Chem， 2008, 80： 474-480.

[14] BECQUEMONT L, FUNCK-BRENTANO C,JAILLO P. Mibefradil, a potent CYP3A inhibitor, does not alter pravastatin pharmacokinetics[J]. Fundam Clin Pharmacol, 1999, 13: 232-236. [15] ALEXANDER M S, KISER M M, CULLEY T, et al. Measurement of paclitaxel in biological matrices: High-throughput liquid chromatographic-tandem mass spectrometric

quantification of paclitaxel and metabolites in human and dog plasma[J]. J Chromatogr B, 2003, 785: 253-261.

[16] ZHANG W, DUTSCHMAN G E, LI X, et al. Quantitation of paclitaxel and its two major metabolites using a liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2011, 879: 2 018-2 022.

[17] VAINCHTEIN L D, THIJSSEN B, STOKVIS E, et al. A simple and sensitive assay for the quantitative analysis of paclitaxel and metabolites in human plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr, 2006, 20: 139-148. [18] HENRIK G, KARIN V, BJORN N, et al. Mea-surement of paclitaxel and its metabolites in human plasma using liquid chromatography/ion trap mass spectrometry with a sonic spray ionization interface[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20: 2 183-2 1. [19] YAMAGUCHI H, FUJIKA W A, ITO H, et al.Quantitative determination of paclitaxel and its metabolites, 6α-hydroxypaclitaxel and p-3'-hydroxypaclitaxel, in human plasma using column-switching liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr, 2012, 27(4): 539-544.

[20] MORTIER K A, RENARD V, VERSTRAETE A G, et al. Development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for the quantification of docetaxel and paclitaxel in human plasma and oral fluid [J]. Anal Chem, 2005, 77: 4 677-4 683.