高效液相色谱法测定茶饮料中的黄酮类化合物

第２７卷第６期　化学研究与应用　Ｖｏ１．２７．Ｎｏ．６　２０１５年６月　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｊｕｎｅ，２０１５　文章编号：１００４．１６５６（２０１５）０６－０８９５－０４　高效液相色谱法测定茶饮料中的黄酮类化合物　张社利　，王保安　，范云场　（１．焦作师范高等专科学校，河南焦作４５４０００；２．河南理工大学物理化学学院，河南焦作４５４００３）　摘要：建立了茶饮料中六种黄酮类化合物的高效液相色谱检测方法。流动相采用梯度洗脱。结果表明芦丁、　漆黄素、木犀草素、芹菜素在０．０２５～２Ｏ　ｍｇ・Ｌ　范围内呈现良好线性关系，桑色素、槲皮素在０．０５０一一２０　ｍｇ・　Ｌ　范围内呈现良好线性关系。加标回收率在８４．５％～１０７．５％。该方法精密度良好（六种黄酮类化合物的相　对标准偏差均不大于３．２％），检测限为６．２～３４｝Ｌｇ・Ｌ一。该方法简便，灵敏、重现性好，可用于同时分析茶饮　料中的黄酮化合物。　关键词：黄酮；茶饮料；高效液相色谱法　中图分类号：０６５７．７　文献标志码：Ａ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｔｅａ　ｄｒｉｎｋｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ＺＨＡＮＧ　Ｓｈｅ．．．１ｉ，ＷＡＮＧ　Ｂａｏ—ａｎ’，ＦＡＮ　Ｙｕｎ．ｃｈａｎｇ　（１．Ｊｉａｏｚｕｏ　Ｔｅａｃｈｅｒｓ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉａｏｚｕｏ　４５４０００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｅｎａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｏｚｕｏ　４５４００３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｘ　ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｔｅａ　ｄｒｉｎｋｓ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｆｒｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｗａｓ　ｅｓ—　ｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｅｔｔｅｒ　ｌｉｎｅａｒｉｙｔ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．０２５～２０　ｍｇ・Ｌ～ｆｏｒ　ｒｕｔｉｎ，ｆｉｓｅｔｉｎ，ｌｕｔｅｏｌｉｎ　ａｎｄ　ａｐｉｇｅｎｉｎ　ａｎｄ　０．０５０～２０　ｍｇ・Ｌ～ｆｏｒ　ｍｏｒｉｎ　ａｎｄ　ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ．Ｔｈｅ　ｓｐｉｋｅｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　８４．５％～１０７．５％．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｅｔｔｅｒ　ｅｒｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　３．２％），ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　６．２—３４　ｇ・Ｌ～．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍ—　ｐｉｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｇｏｏｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｔｅａ　ｄｒｉｎｋｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ；ｔｅａ　ｄｒｉｎｋｓ；ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）　黄酮是一大类天然产物，广泛存在于多种植　草素、芹菜素）进行定量测定，系统考察流动相组　物叶、果实、花中¨Ｊ。近年来的研究表明，黄酮类　成、检测波长对黄酮测定的影响，为茶饮料的评价　化合物具有很强的抗氧化和消除自由基的功　提供参考。　能　。此外，黄酮还具有防治心血管疾病的功　能，如用于降血压、治疗冠心病、抗血栓等功效　。　１　实验部分　茶饮料以其口感好、营养丰富而逐渐成为人们的　１３常饮品，本文采用高效液相色谱法对茶饮料中　１．１仪器和试剂　的六种黄酮（芦丁、漆黄素、桑色素、槲皮素、木犀　Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００型高效液相色谱仪配置紫外可　收稿日期：２０１４－１０－０９；修回日期：２０１５－０１．１０　基金项目：国家自然科学基金项目（２１３０７０２８）资助；河南省科技厅基础与前沿研究项目（１３２３００４１０２９３，１３２３００４１０３８７）资助；河南省高等　学校青年骨干教师计划（２０１３ＧＧＪＳ－０５３）资助　联系人简介：范云场（１９７９・），男，博士，副教授，主要从事色谱分析研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｎｃｈａｎｇｆａｎ２００９＠１６３．ｃｏｒｎ　８９６　化学研究与应用　’　第２７卷　见检测器（美捷司）。ＴＵ．１８１０型紫外可　见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公　司）。　六种黄酮化合物的紫外可见吸收光谱由扫描　相应黄酮标准溶液（均为１０　ｍｇ・Ｌ　）得到，扫描波　长范围：２１０ｎｍ一５００ｎｍ，扫描波长间隔为１ｎｍ。　茶饮料购自本地超市。芦丁（９８％）、漆黄素　（９８％）、桑色素（９８％）、槲皮素（９８．５％）、木犀草　２结果与讨论　２．１流动组成的选择　素（９８％）、芹菜素（９８％）、色谱纯甲醇等药品均购　自阿拉丁试剂（上海）有限公司。其余试剂均为分　析纯，实验用水为超纯水（艾科浦超纯水机）。　１．２色谱条件　若不考虑实际样品基体干扰，六种黄酮化合　物的分离较为容易，以甲醇和０．１％磷酸混合液为　流动相；采用梯度洗脱（方案１）：０—１６ｍｉｎ甲醇保　持５０％，１６～１７ｍｉｎ甲醇升至６０％，并保持至　２１ｍｉｎ，２１—２２ｒａｉｎ甲醇降至５０％并保持至２５ｍｉｎ；　流速０．６ｍＬ・ｍｉｎ～，检测波长２６０ｎｍ；六种黄酮即　可得到较好的分离效果。然而，实际样品基体对　检测波长：３５３ｎｍ，流动相采用甲醇和０．０５％　（体积百分含量）磷酸水溶液的混合溶液。采用梯　度洗脱：０～５４ｍｉｎ，甲醇保持４０％（体积百分含　量），５４～５５ｍｉｎ甲醇升至５５％并保持至６４ｍｉｎ。　美国Ｓｅｐａｘ公司Ａｍｅｔｈｙｓｔ　Ｃ１８一Ｈ色谱柱（４．６　ｍｍ　×１５０　ｍｍ，５　）；进样量２０　Ｌ，柱温２５￣Ｃ。流　速：０．８　ｍＬ・ｒａｉｎ～ｏ　芦丁和漆黄素的测定干扰较为严重（图１，（ａ）和　１．３实验方法　六种黄酮储备液用色谱纯甲醇配制，浓度均　为２００　ｍｇ・Ｌ～。茶饮料经过０．２２　ｍ滤膜过滤后　（ｂ））。考虑到改变流动相是最为简便的排除干扰　的方式。本文对流动相组成进行调整，实验发现　当流动相采用如下梯度（方案２）时基体干扰较小　（图１（ｃ）和（ｄ））：０～５４ｍｉｎ，甲醇保持４０％，５４～　５５ｍｉｎ甲醇升至５５％并保持至６４ｍｉｎ；流速０．８ｍＬ　・ｍｌ—ｎ’，直接进样测试。标准溶液由储备液用超纯水稀释　得到。加标回收率实验如下　取２０ｍＬ茶饮料，分　别加入一定体积的黄酮储备液，摇匀后经过０．２２　ｍ滤膜过滤后直接进样测试。　检测波长３５３ｎｍ。因此，本文选择梯度２　为最佳梯度模式。　一　Ｏ　５　ｌ０　ｌ　５　２０　２５　保留时ｌＴ，Ｊ／ｍｉｎ　保　时问／ｍｉｎ　图１　六种黄酮化合物和凉茶色谱图　Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏ￣ａｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｈｅｒｂａｌ　ｔｅａ　（ａ）六种黄酮化合物１ｏ　ｍｇ・Ｌ　标准溶液色谱图，流动组成为方案１；（ｂ）凉茶色谱图，流动组成为方案１；　（ｃ）六种黄酮化合物１０　ｍｇ・Ｌ　标准溶液色谱图，流动组成为方案２；（ｄ）凉茶色谱图，流动组成为方案２　色谱峰１．６分别为芦丁、漆黄素、桑色素、槲皮素　木犀草素、芹菜素　第６期　张社利，等：高效液相色谱法测定茶饮料中的黄酮类化合物８９７　２．２流动相酸度的选择　磷酸即可获得良好的峰形，本文将０．０５％的磷酸　作为最佳条件。　２．３检测波长的选择　六种黄酮化合物在０．０５％磷酸溶液（为模拟　流动相组成，含４０％甲醇，体积比）中的紫外可见　吸收光谱如图３所示。　１．Ｏ　０．８　｛趑０．６　０．４　Ｏ．２　６　０．Ｏ　２５Ｏ　３Ｏ０　３５０　４００　４５０　５Ｏ０　波长（ｎｍ）　图３　六种黄酮化合物紫外可见吸收光谱　Ｆｉｇ．３　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ａｎｄ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　０　ｌ０　２０　３０　４０　）０　６０　７０　１－６分别为：木犀草、芹菜素、漆黄素、槲皮素、桑色素、　芦丁；六种黄酮化合物的浓度均为１０　ｍｇ・Ｌ　保｝ｆ｝时问，ｍｉｎ　图２磷酸加入量对分离效率的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　从图３可以看出，六种黄酮化合物的最大吸　色谱峰ｌ＿６分别为芦丁、漆黄素、桑色素、　槲皮素、木犀草素、芹菜素；　六种黄酮化合物浓度均为１．０　ｍｇ・Ｌ　收波长均在３５０ｎｍ左右，兼顾到每种黄酮化合物　均要有较大的紫外吸收，本文选择３５３ｎｍ作为最　佳波长。　２．４方法线性范围、检测限、重现性　在最佳实验条件下，六种黄酮化合物的线性　范围，检测限（　Ⅳ＝３）、重现性（相对标准偏差，　考虑到黄酮属于酚类化合物，显弱酸性，本文　考察了磷酸用量对分离效率的影响。实验结果如　图２所示。当磷酸含量为０．１％和０．０５％时，六种　黄酮化合物色谱峰峰形良好，而流动相中不加磷　酸时，桑色素色谱峰严重变形，其原因可能是桑色　素在水中部分电离，导致色谱峰变形，而磷酸的加　人抑制其电离，色谱峰对称性好。鉴于０．０５％的　ＲＳＤ，用１．０　ｍｇ・Ｌ　的标准溶液重复进样６次）及　相关系数（ｒ）如表１所示。由表１可知，六种黄酮　化合物线性良好；相对标准偏差均小于５％，重现　性良好。　表ｌ　六种黄酮线性的范围、重现性及检测限　Ｔａｂｌｅ　１　Ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅｓ。ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｌｉｍｉｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　８９８　化学研究与应用　第２７卷　２．５样品测定及加标回收率实验　考察样品基体对测定的干扰，进行加标回收率实　在最佳实验条件下，对七种茶饮料进行了测　验；加标量和加标回收率如表３所示。六种黄酮　试，实验结果如表２所示。红茶和绿茶中芦丁含　化合物的加标回收率在８４．５％一１０７．５％。　量较高；凉茶中六种黄酮化合物含量均较低。为　表２七种茶饮料测定结果（平均值，ｎ＝３，ｍｇ・Ｌ　）　Ｔａｂｌｅ　２　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｔｈｅ　ｓｅｖｅｎ　ｔｅａ　ｄｒｉｎｋｓ（ａｖｅｒａｇｅ　ｖａｌｕｅｓ，ｎ＝３。ｍｇ・Ｌ　）　‘ＲＳＤ（％）；一　未检出　表３六种黄酮加标回收率实验结果（平均值，ｎ＝３）　Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｐｉｋｅｄ　ｒｅｃｏｖｅｉｒｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｘ　ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ【ａｖｅｒａ￣ｅ　ｖａｌｕｅｓ。ｎ＝３）　ＲＳＤ（％）　参考文献：　［１］斯琴格日乐，范云场，恩德，等．ＨＰＬＣ测定怀菊花中的　ｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ａｃｔａ　帆Ｓ　，２００５，４０（３）：　总黄酮［Ｊ］．光谱实验室，２０１２，２９（６）：３３４２－３３４５．　２８５—２８８．　［２］Ｚｈａｎｇ　Ｇ，Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｐａｎ　Ｊ．Ｐｒｏｂｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌａ．　［４］南海娟，莫海珍，颜振敏，等．槲树叶黄酮的抗氧化特性　ｖｏｎｏｉｄ　ｄｉｏｓｍｅｔｉｎ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｔｒｏ．　研究［Ｊ］．中国食品添加剂，２０１３，（２）：８３－８７．　ｓｃｏｐｉｃ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ，２０１２，６０（１０）：　［５］吴金爽，吴德玲，俞年军，等．ＲＰ—ＨＰＬＣ法同时测定亳　２７２１－２７２９．　菊总黄酮中３种黄酮类成分［Ｊ］．中成药，２０１３，３５（４）：　［３］Ｈｕａｎｇ　Ｘ，Ｌｉ　Ｓ，Ｌｉ　Ｐ．Ｓｉｍｕｈａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　７７４－７７６．　ｍａｉｎ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｆｌｏｓ　ｌｏｎｉｃｅｒａｅ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑ一　（责任编辑李方）