莫能菌素对柔嫩艾美耳球虫的虫种鉴定的研究

试验研究　莫能菌素对柔嫩艾美耳球虫　的虫种鉴定的研究　胡敬华，郝晴晴　（山东省济宁市畜牧兽医局。济宁２７２０３７）　Ｄｏｌ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－６０２７．２０１２．０８．０２５　在集约化养鸡业中，鸡球虫病是最为多发，危害最为严　重而且防治困难、经济损失最为严重的疾病之一。莫能菌素　是聚醚类离子载体抗生素的代表药，是较为理想的抗球虫　药，已广泛应用于世界各地。柔嫩艾美耳球虫引起的疾病称　为盲肠球虫病，对雏鸡的危害最大，病初表现为不饮不食，继　将制作１０个含有单卵囊的胶囊分别接种给ｌ０只雏鸡，　分成１～１０组。８０ｈ后开始换无球虫卵囊的粪盘收集粪便。取　各组粪便，用涂片法检查每组是否有卵囊，每隔２ｈ检查一　次，直至发现有卵囊排出。　１．２．３针对柔嫩艾美耳球虫的虫种鉴定　而由于盲肠损伤，导致发生下痢，血便，以致排出鲜血。　１材料与方法　第一步，卵囊形态观察在有卵囊排出后，换无球虫卵囊　的粪盘收集１０ｈ的鸡粪。每组取一部分鸡粪各放在一个洁净　的烧杯中，加饱和食盐水漂浮，用５０目的金属网筛过滤，静　１．１材料　１．１．１试验动物购自济宁某孵化厂刚出壳的２１８只雏鸡，　置片刻。用吸管取一滴于载玻片上，在显微镜下观察每组卵　囊大小、形状和颜色，每组记录５０个卵囊。利用公式计算：形　状指数：卵囊平均长度／卵囊平均宽度。根据形状指数结　饲养在严格消毒的铁丝笼中，所喂饲料无抗球虫药物，基本　满足雏鸡营养要求。　１．１．２试验药物厂提供。　莫能菌素预混粉料，由山东省济宁市某药　采某鸡厂４周龄肉鸡排出的新鲜的鸡粪，　果，可以排除不符合柔嫩艾美耳球虫卵囊特征的卵囊。其余　形态指数符合的卵囊再经过孢子化，分别感染１只雏鸡再繁　殖一代，收集各株球虫的后代，并取一部分卵囊放置在冰箱　１．１．３卵囊来源１．２方法　通过饱和食盐水漂浮法获取卵囊。　１．２．１针对柔嫩艾美耳球虫的卵囊收集通过饱和食盐水　保存备用。　第二步，潜隐期和最短孢子化时间的测定将每株球虫后　代孢子化后各感染一组雏鸡（每组１０只且体重大致相同），　分笼饲养。在感染后１　１０ｈ换新粪盘开始收集粪便，每隔２ｈ　取少量粪便，用涂片法在显微镜下观察是否存在卵囊。并记　下每组出现卵囊的时间，即潜隐期。取保存在冰箱中的各株　漂浮法获取卵囊，取上层９ｍＬ液体，加２．５％的重铬酸钾　２０ｍＬ，置于２８℃的恒温箱中２ｄ，得到孢子化卵囊。　１．２．２针对柔嫩艾美耳球虫的单卵囊分离用生理盐水稀　释孢子化卵囊液至平均每滴含有１个孢子化卵囊。在低倍镜　下观察，当在载玻片含有一个孢子化卵囊，且卵囊的大小、形　状与柔嫩艾美耳球虫相似，吸取该液滴，滴到铺有琼脂薄板　球虫未孢子化卵囊中各置于一个洁净试管中，加人适量的　２．５％的重铬酸钾放于恒温箱（２８℃）中。从１０ｈ开始每隔１ｈ　用吸管吸取ｌｍＬ的卵囊液放于离心管中，再加９ｍＬ的自来　的载玻片上，将此琼脂薄板移入一个空胶囊中。重复操作，制　作１０个含有单卵囊的胶囊。　作者简介：胡敬华（１９６５～），本科，畜牧师　水，离心１０ｍｉｎ（３０００转／ｍｉｎ）。反复离心３次后，用ｌｍＬ针管　抽取ｌｍＬ溶液接种雏鸡。将接种的雏鸡分笼饲养，在潜隐期　后观察其粪便是否出现卵囊。记录粪便出现卵囊的雏鸡感染　本试验结果表明，发酵床垫料锯木屑和稻壳比为６：４、５：　５、４：６时，发酵床表层及表层下１５ｃｍ处的温度，各组间差异　动，而当锯木屑和稻壳比为６：４和５：５时，则无此现象，说明　当锯木屑和稻壳比为４：６时，发酵效果较差。因此实际生产　中，不建议将锯木屑和稻壳按照４：６混合。考虑到锯木屑来　均不显著（Ｐ＞０．０５）。当垫料中锯木屑和稻壳比为６４时，猪的日　增重最大，但与试验２和试验３组均无显著性差异（Ｐ＞ｎ０５）。说　明３种不同比例的锯木屑和稻壳不会对猪的育肥性能产生影　响。但试验３组日增重最低，可能是由于锯木屑的吸湿ｌ生强于　稻壳，当垫料中锯木屑比例减少时，猪的生长环境差，影响猪　的采食量，从而日增重减少。　虽然３组不同比例的锯木屑和稻壳不会影响发酵效果，　也不会影响猪的育肥性能，但当锯木屑和稻壳比例为４：６　源有限，取材不便，可按照５：５的比例将锯木屑和稻壳混合　使用。　生猪发酵床养殖技术可以使生猪粪便达到无臭味、无排　放、无污染，是一种实现畜禽粪便原位降解的生态环保经济　养殖方式。这一技术顺应生产规律，活用自然资源，它的经济　性、环保性已充分显现，随着社会的发展和人们环保意识的　增强，这一技术必将逐步成为今后养猪的重要方式之一。　时，发酵温度降低，发酵床上常有粪便堆积现象，需人工翻　２０１２年第８期　试验研究　时间，即为最短孢子化时间。　贵，一般实验室条件无法达到。本次实验操作简单无需特殊　仪器。有的学者应用裂殖子直肠分离法分离，此法利用毒害　艾美耳球虫裂殖生殖阶段在小肠中段，配子生殖在盲肠，而　在盲肠配子生殖的只有毒害和柔嫩，这样在小肠中段收集裂　殖子，经直肠感染雏鸡来获得纯种卵囊。还有蔗糖溶液梯度　离心法法以及与胃蛋白酶消化法的结合，离子淘洗法等。这　第三步，感染雏鸡的病理变化记录各组感染球虫雏鸡的　血便情况和死亡率，观察盲肠病理变化。　２结果与分析　２．１单卵囊分离结果与分析共分离出１０个单卵囊，感染　后最终得到８株球虫。３组和９组感染单卵囊的雏鸡未发现　有卵囊排出，其原因可能有二种，一是分离的卵囊在感染前　些方法都可以分离卵囊，但均有一定局限性，例如离心淘洗　法的回收率只有５０％一６０％。　就已死亡，二是接种后卵囊经消化道排出。　２．２虫种鉴定结果与分析　２．２．１　卵囊大小结果　除第１０株卵囊的平均长度　（３５．９　Ｔｎ）、平均宽度（２４．３　ｍ）、形状指数（１．２５）均不符合　柔嫩艾美耳球虫卵囊的特点外，其余株卵囊（１－２，４－８）平均　长度分别为２５．３、１９．９、２１．４、２４．７、１９．６、２２．５、２３．３，平均宽度　分别为２１．３、１７．２、１９．４、１８．４、１７．３、１９．１、２０．４，形状指数分别　为１．１９、１．１６、１．１５、１．１６、１．１３、１．１８、１．１４。所以可以认定第１０　株球虫不是柔嫩艾美耳球虫，可排除。各种球虫卵囊的长度、　３．２琼脂包埋法在单卵囊感染雏鸡的方法中，本实验采用　琼脂包埋法。有的学者采用琼脂糖包埋。琼脂熔点不高，对球　虫卵囊的影响不大，同时琼脂是透明的，不影响在显微镜下　观察球虫卵囊。一些学者对单卵囊分离时采用的琼脂浓度报　道的不尽一致。黄兵等、徐卫东等、陶建平等使用的是１０ｇ／Ｌ　琼脂，且徐卫东等使用ｌｏｒｇＬ琼脂和直径６ｍｍ的胶囊，林青　等，顾有方等使用的是ｌＯｅＣＬ的琼脂。分别用１０、２０、３０、４０ｇ／Ｌ　和５Ｏｇ，＇Ｌ的琼脂作比较，发现琼脂浓度在４０ｇ／Ｌ浇板时琼脂　厚度适宜，大于４０ｇ／Ｌ时偏厚，而且不宜冻干在琼脂中加糖来　制作琼脂板，琼脂液含糖量多少与琼脂板柔韧性密切相关，　未加糖的琼脂在冰箱中冻干后很脆，不宜于包埋，加糖可以　宽度之间存在交叉，就有可能导致在单卵囊分离时出现错　误，因此出现不是柔嫩艾美耳球虫的情况也属正常。　２．２．２潜隐期及最短孢子化时间测定结果潜隐期及最短　孢子化时间测定结果显示，２、５、６株球虫的潜隐期（均为　１２５ｈ）和最短孢子化时间（１９ｈ、１９ｈ、１８ｈ）符合柔嫩艾美耳球　虫的特征，可以初步认定为柔嫩艾美耳球虫；而１、４、７、８株　潜隐期（９７ｈ、１４０ｈ、１４０ｈ、９７ｈ）和最短孢子化时间（１６、１８、１９、　１６）不符合，可排除。　使琼脂板的柔韧性增高。在４￣Ｃ冰箱放置３０ｍｉｎ，可以让琼脂　糖板较好的凝固，冻干后使用时再转移至载玻片上，可以在　切割琼脂糖薄片后容易从载玻片上取下来，防止粘贴，如果　直接从载玻片上取琼脂糖薄片很容易粘贴和撕裂。　３．３虫种鉴定本实验根据卵囊形态观察、肠病变观察、潜　隐期和最短孢子化时问的测定，鉴定出２、５、６株球虫为柔嫩　艾美耳球虫。国内外不少学者用酶电泳技术对鸡球虫进行鉴　定。研究发现，ＬＯＨ和ＧＰＩ同工酶在鸡球虫的鉴定中不失为　一２．２．３　感染雏鸡的病理变化结果在测定完潜隐期及最短　孢子化时间后剖杀各组雏鸡，观察其病理变化（见表１）。　本试验采用卵囊形态观察、肠病变检查、潜隐期和最短　孢子化时间对柔嫩艾美耳球虫进行虫种鉴定，其中２株、５　株、６株均符合柔嫩艾美耳球虫的特征，鉴定为柔嫩艾美耳　球虫。　种有效的手段。根据ＧＰＩ同工酶可以区分早熟和堆型艾美　耳球虫，因为早熟艾美耳球虫有一明显的快带，而堆型艾美　耳球虫则有一条明显的慢带。根据ＬＤＨ同工酶则可以鉴定　论　３讨早熟和布氏艾美耳球虫，因为早熟艾美耳球虫存在一条比其　３．１单卵囊的分离方法国内外一些专家对球虫卵囊分离　它都慢的带；而布氏艾美耳球虫存在一条最快的带，同时，这　两种球虫的ＧＰＩ酶待也明显快于其它５种球虫。　有的学者根据只有和缓艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和　毒害艾美耳球虫３个种可以在鸡胚中完成生活史，通过　４～５ｄ收集的卵囊进行鸡胚感染，再加上对卵囊形态的观察，　可确定和缓艾美耳球虫。通过对６～７ｄ收集的卵囊进行鸡胚　传代，然后收集卵囊感染雏鸡；根据肠病变来确定柔嫩艾美　耳球虫和毒害艾美耳球虫。　技术进行过很多报告道，例如，激光显微镜分离法，需要显微　镜有激光发射系统，将光束调到１０１．ｚｍ（到载玻片上的光斑直　径），能量为１５０Ｊ一２３０Ｊ，能量大小决定卵囊的受损程度，因此　可以纯化卵囊。显微镜操作器分离法，利用显微镜操作器直　接在显微镜下吸取卵囊。还有田光孚等用５ｅｍ高的ＥＤ—　ＴＡ一５２纤维柱，以ｐＨ８．０的甘氨酸缓冲液冲洗，对柔嫩艾美　耳球虫进行提纯。这都需要特殊仪器而且操作复杂，试剂昂　表１　感染雏鸡的病理变化结果　２０１２年第８期　ｅＯａ墨噩蟊豳・・