(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107779438 A(43)申请公布日 2018.03.09
(21)申请号 201710873780.4(22)申请日 2017.09.25(83)生物保藏信息
CGMCC No.14314 2017.08.17
(71)申请人 杭州市第一人民医院
地址 310006 浙江省杭州市上城区浣纱路
261号(72)发明人 张静静 张仕蓉 赵妍妍 马胜林
吴琼 许雅思 黄海琇 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人 沈自军(51)Int.Cl.
C12N 5/09(2010.01)C12N 13/00(2006.01)
(54)发明名称
一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用(57)摘要
本发明公开了一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用。所述放疗耐受肺癌细胞系，命名为人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR，保藏号为：CGMCC No.14314。本发明放疗耐受肺癌细胞系由人肺腺癌细胞株PC9经多次X射线照射和培养后获得的放疗耐受的细胞，放疗耐受性强且稳定，在作为肺癌放疗抵抗机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。
C12Q 1/02(2006.01)A01K 67/027(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图3页
CN 107779438 ACN 107779438 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种放疗耐受肺癌细胞系，命名为人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR，保藏号为：CGMCC No.14314。
2.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系的子代细胞。
3.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系作为肺癌放疗抵抗机制研究的细胞模型中的应用。
4.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系在建立放疗抵抗的哺乳动物肺癌模型中的应用。
5.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系在筛选、提取肺癌放疗耐受分子标志物中的应用。
6.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系在筛选或评估治疗放疗耐受的肺癌的药物中的应用。
7.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系在开发肺癌放疗耐受检测试剂盒中的应用。
8.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系在优化放疗方法中的应用。9.如权利要求1所述的放疗耐受肺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将人肺腺癌细胞株PC9以4Gy的X射线照射后进行培养并稳定传代一次；(2)重复步骤(1)，共照射15次，总剂量60Gy；(3)照射后的细胞稳定培养传代30天，获得所述放疗耐受肺癌细胞系。
2
CN 107779438 A
说 明 书
一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用
1/4页
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，总体预后较差，5年生存率约为17％。目前，放射治疗仍是肺癌综合治疗的重要组成部分，约60％-70％的肺癌患者在病情的不同阶段需要接受放射治疗。随着影像和放疗技术的不断进步，对于无法手术的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，以及局限的Ⅳ期患者，放疗更是作为一种主要的根治性手段而广泛用于临床。对于多处转移的Ⅳ期患者，近年来出现的靶向和免疫药物治疗也为晚期肺癌患者带来了更多的生存时间和机会，这也为放疗在这部分人群中的应用提供了更多的临床空间。然而，临床常规剂量放疗后(50-70Gy)，约40-50％的病例会出现局部病灶未控或复发，放疗耐受是导致局部治疗失败的主要因素。[0003]肿瘤细胞的放疗抵抗性产生是一个多基因、多因子和多机制共同作用的复杂过程，放疗抵抗可能是由于肿瘤异质性，包括肿瘤细胞的起源、病理、病因学和分子/基因发病机理和在治疗过程中发生的获得性抵抗，或者因放射治疗抵抗的肿瘤微环境产生引起。然而，到目前为止，对肺癌细胞产生放疗抵抗的具体机制尚不明确，亟待进一步挖掘和研究。[0004]通过X射线对细胞反复筛选获得具有放疗耐受性的细胞株，与亲本细胞进行对照研究，是在体外研究放疗抵抗机制的重要方法。因此，放疗耐受性细胞株是研究放疗抵抗机制、筛选放疗分子标志物、优化临床放疗策略、实现个体化靶向放疗等生物医学问题的重要材料，建立和鉴定肺癌放疗耐受细胞株，不仅有利于鉴定其分子指纹，深入解析放疗杀伤肿瘤细胞的分子机制，并且有利于筛选出放疗耐受的分子标志物及放疗耐受预测模型的建立。
发明内容
[0005]本发明针对现有技术中缺少放疗耐受的肺癌细胞株的问题，提供了一种放疗耐受肺癌细胞系及其构建方法和应用。[0006]一种放疗耐受肺癌细胞系，命名为人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR(简称PC9-RR)，保藏号为：CGMCC No.14314。本发明放疗耐受肺癌细胞系由人肺腺癌细胞株PC9(简称PC9)经多次循环X射线辐射、培养后获得的一株放疗耐受的细胞，命名为：人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR，于2017年8月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14314。
[0007]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系的子代细胞。所述子代细胞基本或全部保留了亲代细胞的特性。
[0008]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系作为肺癌放疗抵抗机制研究的细胞
3
CN 107779438 A
说 明 书
2/4页
模型中的应用。
[0009]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系在建立放疗抵抗的哺乳动物肺癌模型中的应用。所述的哺乳动物为裸小鼠或裸大鼠。通过将一定细胞数量的所述PC9-RR细胞接种于裸小鼠或裸大鼠的皮下、肝脏、腹腔或者尾静脉等部位，获得放疗抵抗的肺癌的动物模型。
[0010]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系在筛选、提取肺癌放疗耐受分子标志物中的应用。通过与正常的肺细胞及其他种类的癌症细胞进行比较研究，可以发现肺癌的分子标记，特别是放疗耐受有关的分子标记，针对该分子标记可以进行后续的疾病检测及药物开发等方面的应用。
[0011]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系在筛选或评估治疗放疗耐受的肺癌的药物中的应用。首先，通过向所述PC9-RR细胞的培养基中添加不同药物，观察细胞状态变化，获得初步有效的候选药物。然后，将候选药物施药于上述肺癌的动物模型，观察与未施药组动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等，筛选获得潜在治疗放疗耐受性的肺癌的药物。[0012]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系在开发肺癌放疗耐受检测试剂盒中的应用。发现放疗耐受性的肺癌特异性的肿瘤标志物后，可根据该肿瘤标志物开发出检测肺癌放疗耐受相关的检测试剂盒。
[0013]本发明又提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系在优化放疗方法中的应用。使用本发明PCR-RR细胞进行放疗方法的有效性检测，不断优化，以获得最优化的放疗方法。[0014]本发明还提供了所述的放疗耐受肺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：[0015](1)将人肺腺癌细胞株PC9以4Gy的X射线照射后进行培养并稳定传代一次；[0016](2)重复步骤(1)，共照射15次，总剂量60Gy；[0017](3)照射后的细胞稳定培养传代30天，获得所述放疗耐受肺癌细胞系。
[0018]本发明放疗耐受肺癌细胞系由人肺腺癌细胞株PC9经多次X射线照射和培养后获得的放疗耐受的细胞，放疗耐受性强且稳定，在作为肺癌放疗抵抗机制研究的细胞模型等多个方面具有良好的应用前景。
附图说明
[0019]图1为细胞形态光镜观察图，其中A为人肺腺癌细胞株PC9，图B为人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR，放大倍数200×。
[0020]图2为PC9和PC9-RR细胞生长曲线对比图。[0021]图3为PC9和PC9-RR细胞存活曲线对比图，其中图A为单击多靶模型，图B为线性二次模型。
[0022]图4为连续传代三个月后的PC9和PC9-RR细胞存活曲线对比图，其中图A为单击多靶模型，图B为线性二次模型。具体实施方式[0023]实施例1
[0024]1.细胞培养：采用RPMI-10培养基(其中含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM谷氨酰胺)，并置于5％CO2、37℃的恒温培养箱中培养。
4
CN 107779438 A[0025]
说 明 书
3/4页
2.细胞照射：指数生长期的细胞经瑞典Elekta Precise直线加速器6MV—X射线照
射，源皮距100cm，照射野30cm×30cm，剂量率500Gy/min，照射时在培养瓶上加垫1cm厚的补偿块。
[0026]3.放疗抵抗细胞株PC9-RR的建立：取指数生长期的人肺腺癌细胞株PC9(购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)细胞(约35×104个)接种于T25培养瓶中，当细胞生长至60％密度时经X-Ray照射4Gy；照射后立即更换新鲜培养液，每2天换一次液。持续培养至细胞密度达90％时，用胰酶消化传代计数35×104个细胞接种于新的T25培养瓶中，当细胞生长至60％密度时照射4Gy。重复上述培养和照射步骤，当累积剂量达到60Gy时(共经15次、6个月照射)，继续稳定传代30天，最终获得的一株放疗耐受的细胞，命名为：人肺腺癌辐射耐受性细胞株PC9-RR，于2017年8月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14314。[0027]实施例2
[0028]细胞形态学观察：取指数生长期的单层细胞，在倒置相差显微镜下观察其形态差异。
[0029]参照图1所示，在相差显微镜下，正常生长的PC9和PC9-RR细胞形态类似、均呈单层贴壁生长。其中PC9细胞大小相对均一，PC9-RR长梭形细胞增多。[0030]实施例3
[0031]细胞增殖动力学：取PC9和PC9-RR细胞各1×104接种于24孔板(各21孔)，分别对接种培养24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h后的细胞进行消化计数，每个时间节点计数3孔细胞，求平均值绘制细胞生长曲线，并按照如下公式计算群体倍增时间PDT＝t×lg2/(1gNt-lgN0)，其中N0为初始细胞数，Nt是终末细胞数，t为Nt-N0的时间。[0032]参照图2所示，根据生长曲线计算细胞倍增时间，PC9和PC9-RR细胞分别为34h、37h，PC9-RR细胞倍增时间比亲本细胞PC9有所延长。[0033]实施例4
[0034]克隆形成实验：对照组PC9和放疗耐受组PC9-RR细胞经0.25％Trypsin-EDTA消化计数后制成单细胞悬液，依照射剂量不同接种不同数目的细胞至6孔板中，贴壁12h后分别接受0、2、4、6、8、10Gy剂量照射。静止培养14-20天后，甲醇固定20min，0.01％结晶紫染色，对≥50个细胞的克隆计数统计，计算克隆形成率(Plating Efficiency，PE)＝(形成克隆数)/(种植细胞数)×100％，以及细胞存活分数(Surviving fraction，SF)＝实验组克隆形成率/(对照组克隆形成率×PE)。实验重复3次。所得数据在GraphPad Prism 5.0软件进行分析，采用单击多靶模型SF＝1-(1-exp(-k*D))^N和线性二次模型SF＝exp(-(α*D+β*(D^2)))拟合细胞存活曲线，并计算放射敏感性参数N、D0、Dq、SF2、α、β等值进行差异显著性分析。
[0035]参照表1所示，PC9细胞的初始PE值高于放疗耐受组PC9-RR，随着照射剂量的增加，PE和SF值都逐渐降低，但PC9-RR细胞的SF值下降幅度要小于亲本细胞PC9，且细胞存活分数SF值在经X射线照射后也高于PC9细胞，暗示所建立的PC9-RR细胞存活率增加、放疗耐受性更强。
[0036]表1不同剂量照射PC9和PC9-RR细胞后细胞克隆形成率(％)/存活分数(％)
5
CN 107779438 A[0037]
说 明 书
4/4页
参照图3所示，根据SF值，采用单击多靶模型和线性二次模型分别拟合两组细胞的
存活曲线，结果显示PC9-RR存活曲线肩部增宽、曲线右移，表明我们所建立的PC9-RR细胞放疗抗拒性增强。而参照图4所示，连续稳定传代三个月后，PC9-RR细胞的放疗耐受性依旧高于亲本细胞PC9，说明PC9-RR细胞的放疗耐受性具有一定的稳定性。[0039]参照表2所示，根据所拟合的细胞存活曲线，计算两组细胞的N、D0、Dq、SF2、α、β等相关放射敏感性参数，结果显示：PC9-RR细胞SF2值从PC9细胞的40.76上升到60.00(P<0.0001)，D0值从1.94升高到2.47(P<0.01)，Dq值则从0.33提高至1.09(P<0.001)，N值从1.19变化至1.56(P<0.01)；线性二次模型参数α、β和α/β值均有显著性差异(P<0.001)。以上结果表明，建立的PC9-RR细胞与亲本细胞PC9相比，对X射线的抗拒性更强，具有放疗耐受性。[0040]表2 PC9和PC9-RR细胞相关放射敏感性参数
[0041]
[0038]
6
CN 107779438 A
说 明 书 附 图
1/3页
图1
图2
7
CN 107779438 A
说 明 书 附 图
2/3页
图3
8
CN 107779438 A
说 明 书 附 图
3/3页
图4
9