18SrDNA 是相对于基因组而言,18SrDNA 转录后即为18SrRNA。18SrDNA在生物中是最为保守的基因之一,所以也常用来进行生物分类的依据.由于18SrRNA在生物中的表达比较保守,所以目前也用来作为内参。
二、18srRNA内参问题
1 用18s RNA作为RT-PCR的内参,应该和β—actin是一个道理,半定量的目的是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量,内参的目的是去除一些系统误差。
2 有文献做过比较,之所以18s RNA比β—actin好是因为它含量丰富,且任何情况下稳定存在,所以受外界影响小,半定量时背景更加稳定
3 但是不同的是18s是rRNA,没有A尾巴,所以选它作内参时,l理论上总RNA转录时不能用OligodT作反转录引物,用随机引物或6聚体引物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊!如果选β—actin就不存在这个问题,因为它mRNA,有A尾巴.
4 实际上,用18S rRNA做内参,反转录RNA用Oligo dT,能够扩增出来时,对结果也不要表示怀疑.因为普通条件下的反转不会很纯粹,mRNA的含量在总RNA中只占5%,反转时不是仅有它被反转录,即使是rRNA也是可以部分反转成CDNA的,要不分离纯mRNA怎么要用试剂盒进行进行磁珠吸附呢。另外,没有反转的rRNA和tRNA如果没用RNA酶处理也是可以存在很长时间才会完全降解的。这样的18S rRNA做内参是不合适的,它的表达会隋时间推移降低的。
你既然用18S rRNA做内参,就必须让其稳定表达。这样在反转录RNA时除用Oligo dT外,还要用18S反向引物,反转录后的CDNA最好还用RNA酶处理一下,再高温灭活。