HPLC-ELSD法测定缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量

第４０卷第６期　化工技术与开发　Ｖｏ１．４０　Ｎｏ．６　２０１１年６月　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｊｕｎ．２０１　１　ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量　任洪发　（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东肇庆５２６０７０）　摘要：建立了反相高效液相色谱一蒸发光散射检测法（ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ）测定缬氨酸样品中杂质氨基酸含量　的方法。采用Ｈｙｐｅ￣ｉｌ　ＢＤＳ　Ｃ１８色谱柱（４．６ｘ２５０ｍｍ，５ｌｘｍ），以０．１％三氟乙酸乙腈溶液一０．１％三氟乙酸水溶液　为流动相进行线性梯度洗脱，流速为０．８ｍＬ・ｍｉｎ～，在漂移管温度６０℃，氮气流量１．５Ｌ・ｍｉｎ一的条件下，在　２５ｍｉｎ内完成缬氨酸样品中杂质氨基酸的分离测定。在线性范围内，各组分进样质量的常用对数值与峰面积　的常用对数值均呈良好的线性关系。精密度和重复性较好，样品的加样回收率为９７．５％～９８．０％。该方法检测速　度快、检测过程简单方便、检测结果准确可信，可以作为缬氨酸样品中杂质氨基酸含量的检测方法，也为其他　原料药中氨基酸的分析提供了参考。　关键词：反相高效液相色谱；蒸发光散射检测；氨基酸；缬氨酸　中图分类号：Ｏ６５７．３１　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１．９９０５（２Ｏｌ１）０６一ｏｏ３８．０３　Ｌ一缬氨酸含有５个碳原子，支链结构。属于　进行检测。该方法快速、简便，分离效果好，适用　中性氨基酸，是人体必需氨基酸之一。它的用途　广泛，在医药工业，作为营养增补剂，主要用以配　制复合氨基酸输液、合成多肽药物和食品抗氧化　剂等，在食品工业．可用作食品添加剂、营养增补　液及风味剂等。在饲料工业，用于猪饲料中，对母　猪乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。另外，　以缬氨酸为原料可以合成缬更昔洛韦、缬沙坦等　于缬氨酸试验研究中杂质氨基酸的快速检测。　１　实验部分　１．１仪器及试剂　Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高效液相色谱仪．蒸发光散射检　测器（ＥＬＳＤ）３３００，ＭＥ２１５Ｓ型电子天平，。　缬氨酸（Ｖａ１）、丙氨酸（Ａｌａ）、亮氨酸（Ｌｅｕ）、三　原料药。缬氨酸的生产主要采用生物发酵法，副　生的杂质氨基酸比较多，并且杂质氨基酸结构与　缬氨酸相近，难以除去。因此，在缬氨酸的菌种选　育、发酵调节、提取精制等试验研究ｎ　的过程中。　氟乙酸（ＴＦＡ）、乙腈（色谱纯）、缬氨酸供试样品。　１．２标准品混合溶液和供试品溶液的制备　分别精密称取丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸标准　品各约２５　ｍｇ，置于１００　ｍＬ容量瓶中，加水溶解，　稀释定容，配制成标准品混合液。　精密称取缬氨酸供试样品约１００　ｍｇ．置于　１００　ｍＬ容量瓶中，加水溶解，稀释定容，配制成供　试样品溶液。　１．３色谱条件　需要对缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量进行监　控。研究一种快速、简便、高效的检测杂质氨基酸　含量的方法具有重要的意义。　目前，氨基酸的分析方法主要有柱后衍生离　子交换色谱法、柱前衍生高效液相色谱法和离子　色谱法［４］。衍生法操作繁杂，衍生试剂昂贵。离子　色谱法仪器成本高。试验研究中样品成分复杂．　色谱柱Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＢＤＳ　Ｃ１８　４．６ｘ２５０　ｍｍ，５　ｍ。　流动相：（Ａ）０．１％三氟乙酸乙腈溶液；（Ｂ）Ｏ．１％三　检测频率高，需要开发低成本、高效率的检测方　法。有文献报道，利用高效液相色谱一蒸发光散射　检测法（ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ）检测氨基酸无需衍生，应用　范围广，适用于快速测定氨基酸［　。本文尝试采　氟乙酸水溶液。线性梯度洗脱程序：０～５　ｍｉｎ，Ｏ％　Ａ，２０　ｍｉｎ时升至４０％Ａ，２５　ｍｉｎ时降至Ｏ％Ａ；流速　０．８　ｍＬ・ｍｉｎ～；柱温３５℃。漂移管温度６０℃：氮气　流量１．５　Ｌ・ｍｉｎ～；进样量２Ｏ　Ｌ。　用ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法对缬氨酸样品中的杂质氨基酸　作者简介：ｆ￣（１９７６一），男，湖北嘉鱼人，工程师，主要从事食品添加剂和医药原料药的合成研究及管理工作　收稿日期：２０１１－０３—２３　第６期　任洪发：ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定缬氨酸样品中杂质氨基酸的含量　３９　２结果与讨论　２．１流动相的选择　值Ｘ为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结　果见表１。在上述线性范围内，各组分进样质量的　常用对数值与峰面积的常用对数值均呈良好的　线性关系。　表１线性关系考察结果　Ｔａｂｌ　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ｈｎｅａｒ　ｔｅｓｔ　对比甲醇水溶液与乙腈水溶液的分离效果．　甲醇水溶液得到的峰形比较差，部分组分没有完　全分离，乙腈水溶液分离效果稍好．各峰基线分　离，少量拖尾。在水相中加入三氟乙酸后分离效　果明显改善．因为需要采用梯度洗脱．同时在溶　剂相中也加入三氟乙酸后分离效果更佳　对两相　中加入三氟乙酸的量（０．０５％、０．１０％，０．１５％，　０．２０％）进行了考察，结果表明，三氟乙酸的浓度对　峰形有影响，采用０．１％浓度的三氟乙酸效果较　佳。各峰基线分离，峰形尖锐，对称性良好。因此．　选择两相中加入０．１％浓度的三氟乙酸进行检测　试验。　各种氨基酸的保留时间差别比较大，要同时　分析几种氨基酸的含量，需要进行梯度洗脱，在　保证分离效果的情况下进行梯度洗脱减少分析　时间。在上述流动相研究的基础上，试验了不同　梯度洗脱条件对分离效果的影响。在前面色谱条　件中所述的线性梯度洗脱程序下，在２５　ｒａｉｎ内可　以同时检出缬氨酸样品中的杂质氨基酸成分。　２．２检测器参数的选择　蒸发光散射检测器的检测包括雾化、蒸发和　检测三个步骤。漂移管温度和气体流量是影响检　测结果的重要因素。漂移管温度越高，流动相越　容易蒸发，温度过低会导致流动相蒸发不完全，　基线噪音大。气体流量越大，形成的气溶胶越小，灵　敏度降低。因此，需要选择合适的漂移管温度和　气体流量。ＥＬＳＤ３３００中安装有撞击器，只有部分　气溶胶通过漂移管进入到光散射检测池被检测。本　研究中考察了漂移管温度（４０，５０，６０，７０，８０，９０　ｏＣ）　和氮气流量（１．０，１．５，２．０，２．５　Ｌ・ｒａｉｎ　）对检测结果　的影响，结果表明，在漂移管温度６０℃，氮气流量　１．５　Ｌ・ｍｉｎ　时，基线平直，噪音小，灵敏度高。因　此，选择漂移管温度６Ｏ℃．氮气流量１．５　Ｌ・ｒａｉｎ　进行检测。　２．３线性关系考察　精密吸取标准品混合液０．５，２，４，６，８，１０　ｍＬ　分别置于１００　ｍＬ的容量瓶中，加水稀释至刻度，　各取２０　Ｌ进样。按照上述色谱和检测器条件进　行检测，以各氨基酸组分峰面积的常用对数值Ｙ　为纵坐标，以各氨基酸组分进样质量的常用对数　２．４精密度和重复性试验　精密吸取标准品混合液４　ｍＬ置于ｌ００　ｍＬ的　容量瓶中，加水稀释至刻度，取２０ｌｘＬ进样。按照　上述色谱和检测器条件进行检测．连续进样５次．　测得各组分色谱峰保留时问波动为小于０．３　ｍｉｎ，　峰面积相对标准偏差（ＲＳＤ）为０．３６％～１．９２％。说　明检测方法精密度较好。　取同一批缬氨酸供试样品，按照供试品溶液　制备方法平行制备５份样品，分别进样２０１ｘＬ。精　密吸取不同体积的标准品混合液置于ｌＯＯｍＬ的　容量瓶中，加水稀释至刻度，取２０ｌｘＬ进样。按外　标两点对数方程法计算含量的相对标准偏差　（ＲＳＤ），结果为０．６５％～２．０６％。说明检测方法重复　性良好。　２．５回收率试验　精密称取缬氨酸供试样品约１００　ｍｇ，置于容　量瓶中，加入适量的氨基酸标准品混合溶液，按　照供试品溶液的配制方法进行溶液配制，在上述　色谱和检测器条件下进行检测．结果见表２。说明　检测方法回收率比较好。　表２缬氨酸供试样品中丙氨酸和亮氨酸的加样回收率（ｎ＝３）　Ｔａｂ２　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　Ｉｅｕｃｉｎｅ　ａｄｄｅｄ（ｎ＝３）　２．６样品分析　取同一批缬氨酸供试样品，按照供试品溶液　制备方法平行制备３份样品，分别进样２Ｏ　Ｌ。精　密吸取不同体积的标准品混合液置于１００　ｍＬ的　容量瓶中，加水稀释至刻度，取２０　Ｌ进样。在上　述色谱和检测器条件下进行检测，按外标两点对　数方程法计算含量。ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ色谱图见图１，　化工技术与开发　第４０卷　含量检测结果见表３。缬氨酸供试样品中主要杂　质氨基酸为丙氨酸和亮氨酸。　方法可以参考本研究进行试验。高效液相色谱一　蒸发光散射检测器联用检测氨基酸的方法，样品　不需要衍生化就可以直接进样分析．简化了样品　的前处理过程，减小了检测误差．结果更加准确　可靠。该方法可以用于试验研究中发酵液、中间　滤液和粗品等缬氨酸样品的质量控制。　参考文献：　［１］王平，何英，贺小伟，等．Ｌ一缬氨酸菌种的选育及其发　酵条件［Ｊ］．大连轻工业学院学报，２００２，２１（２）：ｌｌ６．　１ｌ９．　０　２．５　５．０　７．５　１０．０　１２．５　ｌ５．０　１７．５　２０．０　２２．５　陈刚，王开国，浦军平，等．改进Ｌ一缬氨酸发酵工艺的　实验研究［Ｊ］．大连轻工业学院学报，２００３，２２（１）：４ｌ一　４３．　１．Ａｌａ；２．Ｖａｌ；３．Ｌｅｕ．　ｆｍｉｎ　图１　缬氨酸供试样品ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ色谱图　Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｌｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　秦永锋，徐庆阳．谢希贤，等．柠檬酸钠对ＩＪ－缬氨酸发　酵及代谢流量分布的影响［Ｊ］．天津科技大学学报，　２０１０，２５（２）：１０－１２．　表３缬氨酸供试样品中丙氨酸和亮氨酸的含量（ｎ＝３）　Ｔａｂ３　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ￣ａｕｌｎｅ　ａｎｄ　ｌｅｕｃｉｎｅ　于泓，牟世芬．缬氨酸产品中微量氨基酸杂质的高效　１ｊ　ｉｎ　ｖａｌｉｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ｎ＝３）　１Ｊ　１ｊ　阴离子交换色谱一积分脉冲安培测定［Ｊ］．分析测试学　１Ｊ　１Ｊ　１Ｊ　Ｃ￣ｍｐｃｎｅｎｔ　Ｃｏｎｔｅｎｔ／％　ＲＳＤ／％　报，２０ｏ７，２６（６）：８６２—８６５．　鄢丹，韩玉梅，董小萍．反相高效液相色谱一蒸发光散　Ｌｅｕ　１＿３１　２．５８　射检测法同时测定阿胶中的１７种未衍生氨基酸［Ｊ］．　色谱，２００６，２４（４）：３５９—３６２．　３　结论　本研究对缬氨酸样品中的主要杂质氨基酸　丙氨酸和亮氨酸的含量进行了分析。由于缬氨酸　中丙氨酸和亮氨酸杂质难以通过简单处理除去，　鄢丹，张毅，韩玉梅，等．ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定疏血通注　射液中ｌ７种未衍生氨基酸含量［Ｊ］．药物分析杂志，　２００７，２７（４）：５５８—５６０．　陈鼎雄，林立．ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ法测定复方氨基酸注射　液（３ＡＡ）中三组分的含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００７，２７　（１０）：１６４９—１６５１．　因此．主要研究了缬氨酸中杂质氨基酸丙氨酸和　亮氨酸的含量检测方法。其它杂质氨基酸的检测　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　Ｖａｌｉｎｅ　Ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ　ＲＥＮＨｏｎｇ－ｆａ　（ＳｔａｒＬａｋｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｏｆＺｈａｏｑｉｎｇＧｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｚｈａｏｑｉｎｇ　５２６０７０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｖａｌｉｎｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｒｅ～　ｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ．ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃ—　ｔｉｏｎ（ＥＬＳＤ　１．Ａ　ｈｙｐｅｒｓｉｌ　ＢＤＳ　Ｃ　ｌ　８　ｃｏｌｕｍｎ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　０．１％ｔｒｉｌｆｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｃｅｔｏｎｉ—　ｔｒｉｌｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ一０．１％ｔｒｉｌｆｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ．ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｄｒｉｔｆ　ｔｕｂｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　６０℃ａｎｄ　ｔｈｅ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　１．５　Ｌ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｆｒａｔｅ　ｗａｓ　０．８　ｍＬ／ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎ　２５ｍｉｎ．Ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎ—　ｅａｒｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉ．　ｔｙ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｗａｓ　９７．５％－９８．０％．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ．Ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ａｎｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｒｅｖｅｒｓｅｄ・ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ—ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ：ｖａｌｉｎｅ